style="width:2.65343in;height:0.68002in" /> ………………………… (1) 本文是学习GB-T 14702-2018 添加剂预混合饲料中维生素B6的测定 高效液相色谱法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了添加剂预混合饲料中维生素Bg(盐酸吡哆醇)测定的高效液相色谱法。
本标准适用于维生素预混合饲料和复合预混合饲料中维生素 B, 的测定。
紫外检测器色谱条件下的定量限为30 mg/kg;
荧光检测器色谱条件下的定量限为10 mg/kg。
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料 采样
GB/T 20195 动物饲料 试样的制备
试样中维生素 B,
经酸性提取液超声提取后，注入高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分离，用紫
外检测器(二极管矩阵检测器)或者荧光检测器检测，外标法计算维生素 B₅
的含量。
除特殊说明外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水为去离子水，符合
GB/T 6682 中一级
用水规定。
4.1 二水合乙二胺四乙酸二钠(EDTA): 优级纯。
4.2 庚烷磺酸钠(PICB₇): 优级纯。
4.6 盐酸溶液：取8.5 mL 盐酸，用水定容至1000 mL。
4.7 磷酸二氢钠溶液：3.9 g 磷酸二氢钠溶于1000mL 超纯水中，过0.45 μm
水系滤膜。
4.8 提取剂：在1000 mL 容量瓶中，称50 mg (精确至0.001 g)EDTA(4.1)、
依次加入700 mL 去离子 水，超声使EDTA 完全溶解。加入25 mL 冰乙酸(4.3)、5
mL 三乙胺(4.4),用去离子水定容至刻度，摇 匀。取该溶液800 mL 与200 mL
甲醇混合，超声脱气，待用。
4.9 流动相：在1000mL 容量瓶中，称50 mg (精确至0.001 g)EDTA(4.1)、1.1g
(精确至0.001 g)庚烷 磺酸钠(4.2),依次加入700 mL 去离子水，25 mL
冰乙酸(4.3)、5 mL 三乙胺(4.4),用去离子水定容至
刻度，摇匀。用冰乙酸、三乙胺调节该溶液 pH 至3.70±0.10,过0.45 μm
滤膜。取该溶液800 mL 与
200 mL 甲醇(4.5)混合，超声脱气，备用。
GB/T 14702—2018
4.10.1 维生素B, 标准贮备液：准确称取维生素 B; (维生素 B;
纯度大于98%)0.05 g (精确至0.0001 g) 于 100mL
棕色容量瓶中，加盐酸溶液(4.6)约70 mL, 超 声 5 min,
待全部溶解后，用盐酸溶液(4.6)定容至 刻度。此溶液中维生素 B,
浓度为500μg/mL,2℃~8℃ 冰箱避光保存，可使用3个月。
4.10.2 维生素 B 标准工作液A: 准确吸取2.00 mL 维生素
B。标准贮备液(4.10.1)于50 mL 棕色容量
瓶中，用磷酸二氢钠溶液(4.7)定容至刻度。该标准工作液中维生素
B。浓度为20μg/mL,2℃~8℃ 冰 箱避光保存，可使用一周。
4.10.3 维生素 B, 标准工作液 B: 准确吸取5.00 mL 维生素 B,
标准工作液 A(4.10.2)于50 mL 棕色容
量瓶中，用磷酸二氢钠溶液(4.7)定容至刻度。该标准工作液中维生素 B,
浓度为2.0μg/mL, 上机测定 前制备，可使用48 h。
5.1 高效液相色谱仪：配紫外检测器(二极管矩阵检测器)或荧光检测器。
5.2 pH 计(带温控，精度为0.01)。
5.4 针头过滤器：备0.45 μm 水系滤膜。
按 GB/T 14699.1的规定，抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。按
GB/T 20195 制备试
样，磨碎，通过0.425 mm 孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。
以下操作应避免强光照射。
称取维生素预混合饲料试样0.25 g～0.5 g(精确至0.0001
g);复合预混合饲料试样2 g～3g (精确 至0.0001 g),于100 mL
棕色容量瓶中，加入70 mL 磷酸二氢钠溶液(4.7)在超声波提取器(5.3)中超
声提取20 min
(中间旋摇一次以防样品附着于瓶底),待温度降至室温后用提取剂定容至刻度，过滤(若
滤液浑浊则需5000 r/min 离心5 min)。 溶液过0.45 μm 滤膜(5.4),其中维生素
B₈ 浓度约为2.0μg/
mL～100μg/mL, 待上机。
色谱柱：Cis,长250 mm, 内径4.6 mm, 粒度5 μm, 或性能相当的Cis柱。
流动相：见4.9。
流速：1.0 mL/min。
柱温：25℃~28℃
进样体积：10μL～20μL。
检测器：紫外或二极管矩阵检测器，检测波长290 nm。
GB/T 14702—2018
色谱柱：Cis, 长250 mm, 内径4.6 mm, 粒 度 5 μm, 或性能相当的 Cis 柱。
流动相：A: 磷酸二氢钠溶液(4.7),B: 甲醇。梯度淋洗程序参见表1。
表 1 梯度淋洗程序
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流速：1.0 mL/min。
柱温：25℃~28℃。
进样体积：10μL～20μL。
检测器：荧光检测器，激发波长293 nm; 发射波长395 nm。
根据所测样品维生素 B, 的含量向色谱仪注入工作液 A(4. 10.2) 或工作液
B(4. 10.3) 及试样溶液
(7.1),得到色谱峰面积的响应值，用外标法定量计算。维生素 B₈
荧光检测器色谱图参见附录 A。
试样中维生素 B, (盐酸吡多醇)的含量，以质量分数 w
计，单位以毫克每千克(mg/kg) 表示，按式
(1)计算
style="width:2.65343in;height:0.68002in" /> ………………………… (1)
式中：
A;— 试样溶液峰面积值；
V — 试样稀释体积，单位为毫升(mL);
c — 标准溶液浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
V;— 试样溶液进样体积，单位为微升(μL);
Vsi— 标准溶液进样体积，单位为微升(μL);
A、i— 标准溶液峰面积平均值。
m — 试样质量，单位为克(g);
测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
对于维生素 B; 含量大于或者等于500 mg/kg
的饲料，在重复性条件下，获得的两次独立测定结果
GB/T 14702—2018
与其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的5%。
对于维生素 B, 含量小于500 mg/kg
的饲料，在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算术
平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的10%。
style="width:3.11331in" />GB/T 14702—2018
(资料性附录)
维生素 B₆ 标准色谱图
液相色谱-紫外检测器色谱条件下维生素 B₈ 标准色谱图见图 A.1;
液相色谱-荧光检测器色谱条件
下维生素 B, 标准色谱图见图 A.2。
style="width:8.18008in;height:4.48008in" />AU
图 A.1 液相色谱-紫外检测器色谱条件下维生素 B₆
标准色谱图(维生素 B₆ 浓度为10μg/mL)
style="width:7.93998in;height:3.89334in" />
图 A.2 液相色谱-荧光检测器色谱条件下维生素 B₆ 标准色谱图(维生素 B₆
浓度为18μg/mL)
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